Análise proteômica de formas tripomastigotas diferenciadas in vitro do Trypanosoma rangeli e caracterização de antígenos diferenciais ao Trypanosoma cruzi

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2012A distribuição simpátrica e o compartilhamento de hospedeiros e antígenos entre o Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas podem levar a erros nos diagnósticos e inferências epidemiológicas destes parasitos. Neste sentido, apresentamos o primeiro estudo proteômico comparativo em grande escala das proteínas solúveis e de superfície da forma tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi, objetivando a identificação de proteínas com potencial aplicação no diagnóstico diferencial destes parasitos. Neste estudo foram identificadas 137 distintas proteínas solúveis da forma tripomastigota de T. rangeli resolvidas no perfil 2-D por espectrometria de massas (LC-ESI-MS/MS). Destas, 76% localizadas no citosol ou mitocôndrias e 26% envolvidas no metabolismo energético ou na resposta ao estresse. Além disto, através de ensaios de immunoblotting 1-D com estas proteínas solúveis e antissoros de animais experimentalmente infectados com estes parasitos, foi verificado que a reatividade sorológica cruzada existente entre estes dois parasitos não é recíproca, pois o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli é menos intensa do que o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. cruzi pelos antissoros heterólogos. Também observamos que proteínas das formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi na faixa de 70-80kDa são reconhecidas exclusivamente pelos antissoros homólogos. Nos ensaios de immunoblotting 2-D foi observado um forte reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli pelo antissoro homólogo na faixa entre 60-100kDa. Apesar disto, não foi possível identificar marcadores específicos destes parasitos com estes ensaios. Porém, a análise proteômica comparativa das proteínas de superfície das formas epimastigota e tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi permitiu a identificação de potenciais marcadores específicos de T. rangeli. Esta análise foi realizada utilizando duas abordagens, sem (LC-MS-MS/MS) e com o uso de gel (GeLC-ESI-MS/MS), além de ensaios de immunoblotting 1-D, que revelaram um padrão de reconhecimento das proteínas de superfície distinto para cada espécie. Com isto foi possível identificar 138 proteínas de T. rangeli e 343 proteínas de T. cruzi, das quais 42 e 157 proteínas exclusivamente nas formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi, respectivamente. Em particular, as análises de MS/MS revelaram pelo menos duas proteínas de T. rangeli, GP63-relacionada (~70kDa) e FCaBP (~25kDa), como potenciais alvos para o diagnóstico diferencial com T. cruzi. Desta forma, esta análise proteômica em larga escala das proteínas de superfície de T. rangeli, revelou diferenças e semelhanças entre as proteínas de superfície destes parasitos, além de permitir a identificação de novas proteínas de T. rangeli com potencial aplicação no diagnóstico diferencial com T. cruzi.Abstract : Sympatric distribution and sharing of hosts and antigens by Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi the etiological agent of Chagas' disease, often incur in misdiagnosis and improper epidemiological inferences. In order to identify differential antigens with potential application in serological diagnosis we performed the first high-throughput proteomic analysis of soluble and surface proteins (SP) of T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes. In this work, 137 non-redundant T. rangeli trypomastigote soluble proteins resolved in 2-D profile were identified by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Within these 137 non-redundant proteins, 76% are cytosolic or mitochondrial and 26% are involved in energy metabolism or response to stress. Furthermore, 1-D immunoblotting assays with soluble proteins and antisera from animals experimentally infected showed a less intense recognition of T. rangeli trypomastigotes soluble proteins than T. cruzi trypomastigotes proteins by heterologous antisera indicating that serological cross-reactivity between these parasites is not reciprocal. In addition, T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes soluble proteins between ~70-80 kDa were exclusively recognized by homologous antisera suggesting specie-specific antigens among the trypomastigote proteins. We also observed a strong recognition of T. rangeli trypomastigotes proteins by homologous antiserum between ~60- 100kDa in 2-D immunoblotting tests. Unfortunately, we were not able to identify specific markers of these parasites through these trials. On the other hand, the comparative proteomic analysis of T. rangeli and T. cruzi epimastigote and trypomastigote SP pointed out potential T. rangeli specific-markers, using gel-free (LC-ESI-MS/MS) and gel-based (GeLC-ESI-MS/MS) proteomic approaches. Besides, immunoblotting revealed distinct recognition profiles of SP for each species. A total of 138 T. rangeli proteins and 343 T. cruzi proteins were identified, of which, 42 and 157 proteins were exclusively identified in T. rangeli or T. cruzi trypomastigotes, respectively. MS/MS analysis of T. rangeli exclusive bands revealed two unique proteins, GP63-related (~70kDa) and flagellar calcium-binding protein (FCaBP) (~25kDa), as potential markers. This highly sensitive proteomic assessment of surface proteins characterized the T. rangeli surfaceome, revealing several differences and similarities between these two parasites and new T. rangeli-specific proteins with promising use in differential diagnosis from T. cruzi

POLIMORFISMO XPD K751Q EM PACIENTES COM MELANOMA NA REGIÃO DO MEIO-OESTE CATARINENSE

O melanoma é um tumor maligno cujo diagnóstico precoce está associado a uma maior chance de cura. A exposição ao sol está associada ao aparecimento de melanoma, entretanto, não está descartada a associação do melanoma e a sua origem genética, ou seja, certos genes herdados podem contribuir para a predisposição no desenvolvimento do tumor. Dessa forma, identificar esses genes, bem como seus polimorfismos, possibilita a aplicação de diagnóstico e prevenção em estágios iniciais do desenvolvimento tumoral e uma maior expectativa de cura. Teve-se, como objetivo deste estudo, avaliar a frequência do polimorfismo do gene XPD K751Q, responsável por uma das etapas de reparo do DNA, em pacientes com melanoma na região do Meio-Oeste catarinense. Após a extração do DNA de um grupo de pacientes com histórico de melanoma (13) e de outro grupo sem histórico (9), foram realizadas as técnicas de PCR e RFLP, utilizando iniciadores e enzimas específicas para o polimorfismo do gene XPD K751Q. Os resultados deste estudo demonstraram que em 61% (n=8) dos pacientes com melanoma apresentaram genótipo Gln/Gln (Q/Q) e no grupo controle 55% (n=5) apresentaram o mesmo genótipo. Quanto ao fotótipo, pacientes com classificação I e II tiveram prevalência de 60% do genótipo Q/Q em relação aos demais genótipos, já os fotótipos III e IV prevaleceram com genótipo heterozigoto, sendo os fotótipos I e II com sabidos riscos elevados no desenvolvimento do melanoma. Apesar de serem dados preliminares, pode-se concluir que indivíduos da região do Meio-Oeste catarinense com o genótipo homozigoto Q/Q e com os fotótipos I e II apresentam potencial risco de desenvolvimento de melanoma.Palavras-chaves: XPD. K751Q. Melanoma

ANÁLISE FILOGENÉTICA DO Trypanosoma rangeli UTILIZANDO TRANSCITOS DE GENES METABÓLICOS

A análise filogenética a partir de marcadores moleculares é amplamente empregada para demonstrar as relações evolutivas entre determinados organismos. Contudo, a escolha do marcador deve ser realizada com bastante critério, pois o uso de diferentes marcadores pode resultar em topologias de grupos bastante discrepantes da realidade biológica dos grupos. Em tripanosomatídeos, vários genes ou marcadores já foram empregados para estabelecer as relações evolutivas entre os organismos desse grupo. Em especial para o Trypanosoma rangeli, várias análises com marcadores já foram realizadas, como 18S rRNA, beta tubulin, cysteina protease e Glucose-6-phosphate Isomerase (GPI), porém, alguns destes demonstrando uma correlação taxonômica mais próxima ao T. cruzi e outros, ao T. brucei. Além disso, essas análises sempre utilizaram esses marcadores de maneira isolada; contudo, a utilização de vários marcadores filogenéticos concatenados tem se mostrado como uma estratégia de avaliação filogenética mais precisa e confiável, incluindo genes metabólicos. Assim, este estudo teve como objetivo principal revisar a posição taxonômica do T. rangeli partindo da filogenia de genes metabólicos concatenados. Para isso, foram selecionados 328 transcritos de genes metabólicos de T. rangeli depositados no programa Stingray (System for Integrated Genomic Resources and Analysis). Utilizando essas sequências, foi realizada a análise de similaridade com os genomas de espécies de Trypanosoma e Leishmania depositadas no GeneDB. Com base nessa análise, foram selecionados apenas oito marcadores comuns a todas as espécies para a reconstrução filogenética. Em seguida, os marcadores (sequencias nucleotídicas e proteínas) de cada espécie foram concatenados, o alinhamento múltiplo foi realizado utilizando o programa ClustalW e os marcadores foram submetidos ao programa MEGA 5. Para as reconstruções filogenéticas foram utilizados os métodos JC (Jukes-Cantor), distância de Kimura 2-parâmetros e distância p, com o algoritmo de reconstrução da árvore NJ (neighbor-joining) e bootstrap 1000. A partir da reconstrução filogenética utilizando o método da distância p, foi possível observar a formação de um clado contendo o T. cruzi e o T. rangeli (Secção Salivaria) e excluindo o T. rangeli da Secção Stercoraria, formada pelo T. brucei e pelo T. congolense, com valores de bootstraps maiores daqueles obtidos quando utilizados os marcadores de forma isolada. Com base nesses resultados, pode-se concluir que a utilização dos marcadores de forma concatenada demonstrou uma estratégia válida para a resolução de filogenias complexas e duvidosas. Bem como demonstrou maior correlação evolutiva entre o T. rangeli e o T. cruzi.Palavras-chave: Filogenia. Trypanosoma rangeli. Bioinformática

PERFIL DOS ANTICORPOS DA CLASSE IgG DURANTE INFECÇÃO EXPERIMENTAL DE Trypanosoma cruzi E Trypanosoma rangeli EM CAMUNDONGOS

A reatividade sorológica cruzada entre Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli pode influenciar no diagnóstico para a doença de Chagas gerando resultados falso-positivos. Isso acontece por serem morfologicamente e antigenicamente semelhantes e por compartilharem vetores e hospedeiros mamíferos, além de possuirem uma distribuição geográfica sobreposta. Na doença de Chagas ocorre uma formação de anticorpos IgM durante a fase aguda, porém com o decorrer da infecção o nível de parasitemia é modulado principalmente pelos anticorpos da classe IgG. Durante as infecções causadas por T. rangeli o isotipo IgG se apresenta em menores títulos do que uma infecção por T. cruzi. Dessa forma, este trabalho pretende avaliar o perfil dos anticorpos da classe IgG para T. cruzi e T. rangeli em camundongos durante uma infecção experimental. Para tal, parasitos foram cultivados in vitro (cepas de T. rangeli Choachí e T. cruzi Y) utilizando meio LIT e as formas tripomastigotas de T. rangeli e T. cruzi foram obtidas em cultura com meio DMEM e em culturas envelhecidas, respectivamente. Foram inoculadas 1.000 formas tripomastigotas por via intraperitoneal e os antissoros obtidos por meio de coletas sequenciais durante 33 dias, com acompanhamento da parasitemia. A reatividade sorológica cruzada foi avaliada por meio de ensaios de immunoblotting no qual se observou um aumento dos níveis séricos de anticorpo IgG em torno do 14° dia até 33º dia, indicando uma resposta humoral bem estabelecida. As proteínas totais da forma epimastigota de ambos os parasitos foram reconhecidas mais intensamente pelos seus soros homólogos quando comparados aos antissoros heterólogos. Contudo, observou-se maior constatação das proteínas de T. cruzi reconhecidas pelo antissoro heterólogo, indicando a possibilidade de sororeatividade cruzada durante diagnóstico da doença de Chagas. Ao longo da infecção, a titulação e a isotipagem dos anticorpos por intermédio de ELISA demonstraram que a subclasse de anticorpo mais abundante é de IgG2b.Palavras-chave: Doença de Chagas. Reatividade sorológica cruzada. Trypanosoma rangeli. Anticorpo. IgG. ELISA.

ACOMPANHAMENTO DA RESPOSTA HUMORAL DURANTE INFECÇÃO EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS COM Trypanosoma cruzi E Trypanosoma rangeli ATRAVÉS DE ENSAIOS DE IMMUNOBLOTTING

O Trypanosoma rangeli é um parasito não patogênico que infecta diversos mamíferos nas Américas, inclusive humanos. Em virtude das semelhanças morfológicas e antigênicas com o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, há possibilidade de erros no diagnóstico para doença em decorrência de resultados falso-positivos. Na doença de Chagas ocorre uma formação de anticorpos IgM durante a fase aguda, porém, com o decorrer da infecção, o nível de parasitemia é modulado principalmente pelos anticorpos da classe IgG. Durante as infecções causadas por T. rangeli, o isotipo IgG se apresenta em menores títulos do que em uma infecção por T. cruzi. Dessa forma, este trabalho pretendeu avaliar a resposta imune humoral com base na reatividade sorológica de anticorpos da classe IgG para T. cruzi e T. rangeli em camundongos durante uma infecção experimental. Para tal, os parasitos foram cultivados in vitro (cepas de T. rangeli Choachi e T. cruzi Y) utilizando meio LIT, e as formas tripomastigotas de T. rangeli e T. cruzi foram obtidas em cultura com meio DMEM e em culturas envelhecidas, respectivamente. Foram inoculadas 1000 formas tripomastigotas por via intraperitonial, e os antissoros foram obtidos por meio de coletas sequenciais durante 33 dias, com acompanhamento de parasitemia. A reatividade sorológica cruzada foi avaliada por intermédio de ensaios de immunoblotting nos quais foi observado um aumento dos níveis séricos de anticorpo IgG em torno do 14° dia, permanecendo elevados até o 33° dia. As proteínas totais da forma epimastigota de ambos os parasitos foram reconhecidas mais intensamente pelos seus soros homólogos em comparação com os antissoros heterólogos. Contudo, observou-se maior constatação das proteínas do T. cruzi reconhecidas pelo antissoro heterólogo, indicando a possibilidade de sororeatividade cruzada durante o diagnóstico da Doença de Chagas. Dessa forma, outros ensaios estão sendo realizados para esclarecer e determinar a classe de anticorpo envolvida na resposta sorológica cruzada, bem como se esta se mantém em infecções crônicas prolongadas.Palavras-chave: Doença de Chagas. Reatividade sorológica cruzada. Trypanosoma rangeli. Anticorpo. IgG.

PADRONIZAÇÃO DA PCR-RFLP PARA A GENOTIPAGEM DOS ALELOS CYP2E1 *1A/*5B A PARTIR DE DNA OBTIDO DA MUCOSA ORAL

O metabolismo de xenobióticos é desempenhado por enzimas da família do citocromo P450; entre elas, destaca-se a enzima CYP2E1, que é responsável pelo metabolismo de compostos hidrofílicos de baixo peso molecular, nitrosaminas, benzeno, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, entre outros. Esse gene possui dois alelos, nos quais a presença do alelo tipo mutante (5B) demonstra maior taxa de transcrição e atividade enzimática, causando assim, um desequilíbrio de subprodutos gerados para a fase II do metabolismo. Este trabalho teve como objetivo padronizar a análise dos alelos *1A e *5B do gene CYP2E1 no Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Unoesc, com o estabelecimento de um protocolo padrão para a extração de DNA em amostras de mucosa oral e análise de RFLP (Analise do polimorfismo pelo tamanho de fragmentos gerados por restrição enzimática) para a determinação do genótipo das amostras. Para tal, amostras da mucosa oral de 20 voluntários foram coletadas e a extração realizada pelo método de salting-out. Para a amplificação do fragmento, foram utilizados 10 pmol de cada iniciador (CYPE2F 5'-CCAGTC GAG TCT ACA TTG TCA-3' e CYPE2R 5'-TTC ATT CTG TCT TCT AAC TGG-3'), 5 U de Taq DNA Polimerase, tampão de reação da enzima (10 mM Tris HCl, pH 8,5; 50 mM KCl) e 1,5 mM de MgCl2 e 2 mM de dNTP e aproximadamente 100 ng de DNA. As condições da PCR foram de 35 ciclos a 92 °C por um minuto, 60 °C por um minuto, e 72 °C por um minuto.  Após a amplificação, 10 μl do produto da PCR foi submetido à digestão durante 12 horas a 37 °C com a enzima de restrição PstI, 90 mM Tris HCl (pH7,5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10mM DTT, 10ug/μl de BSA e 5 unidades da enzima, seguidas da inativação a 65 °C por 15 minutos. Para a determinação do genótipo do gene CYP2E1 nos indivíduos, é realizada a partir da análise do perfil de restrição obtido, onde a ausência da sítio de restrição para a enzima PstI, banda de 410 pares de base (pb), indica alelo tipo selvagem clivagem (*1A), já no caso da presença do sítio de restrição desta enzima, resultara na clivagem do amplicon em dois fragmentos, 290 pb e 120 pb, demonstrando a presença do alelo tipo mutante (*5B). Desta forma, com base nesta metodologia, podemos realizar a análise da frequência dos alelos *1A e *5B do gene CYP2E1 em trabalhadores expostos a xenobióticos, podendo ser utilizado como marcadores de susceptibilidade ao desenvolvimento de neoplasias relacionado à cabeça e pescoço.Palavras-chave: Citocromo; PCR; Xenobiótico.CONTATO: [email protected]

ESTUDO DE CASO FAMILIAR COM DIAGNÓSTICO PARA DOENÇA DE FABRY

A doença de Fabry é uma doença rara causada por um erro inato do metabolismo, fazendo parte do grupo das doenças de depósito lisossômico. De origem genética e com herança ligada ao cromossomo X, a doença manifesta-se em decorrência da mutação no gene que codifica a enzima lisossomal alfa galactosidase. Com isso, há o acúmulo de glicoesfingolipídeos no interior do endotélio e músculo liso de vasos sanguíneos e em diversos órgãos, principalmente o coração, os rins, a pele, o sistema nervoso, os olhos e o trato gastrointestinal. Teve-se, como objetivo deste trabalho, acompanhar e estudar os aspectos clínicos e de herança de um caso familiar com diagnóstico genético da doença de Fabry. Esta pesquisa qualitativa e exploratória foi realizada por meio de entrevistas com oito pacientes e a partir da análise de dados de avaliações clínicas feitas por estes com diferentes profissionais. O estudo propiciou a compreensão dos aspectos clínicos que cercam a doença de Fabry, sendo observados sintomas característicos dessa patologia como: crise de dor generalizada, fadiga, acroparestesia, febre, mialgia, dor abdominal, hipohidrose, intolerância ao frio, ao calor e ao exercício físico em ambos os pacientes, sintomas estes que, segundo os pacientes, foram amenizados após o uso da terapia de reposição enzimática propiciando uma melhor qualidade de vida para eles. Também, observaram-se sinais específicos nos pacientes, como córnea verticillata (paciente 13 do heredograma) e angioqueratoma (paciente 11 e 14 do heredograma). Com isso, pode-se concluir que apesar de ser uma afecção rara na população em geral, por meio do diagnóstico precoce, da terapia de reposição enzimática e do acompanhamento adequado das complicações da doença, é possível permitir ao doente uma evolução favorável das condições clínicas pertinentes ao caso.Palavras-chave: Doença de Fabry. Alfa galactosidase. Terapia de reposição de enzimas

NOTAS SOBRE A FAUNA DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE: PHLEBOTOMINAE) NOS MUNICÍPIOS AO LONGO DO RIO DO PEIXE, CENTRO-OESTE DE SANTA CATARINA, BRASIL

We aimed to find out the sand fly species in five municipalities along the Peixe River in the west of Santa Catarina state, Brazil, and verify the presence of females naturally infected with Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle. Phlebotomine were collected using a Falcão light trap and identified through morphology. A total of 149 specimens of 10 phlebotomine species were identified, four of which were already reported with natural Leishmania spp. infection. However, using amplification of L. (L.) infantum kDNA through multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay, no natural infection was observed in these specimens. The region is non-endemic for leishmaniasis and the low amount of collected specimens may have contributed to the negative results. However, the simultaneous presence of phlebotomine species reported in the literature as naturally infected with Leishmania spp. and a recent report of dogs naturally infected with L. (L.) infantum demonstrate the need to expand monitoring in this geographical region, particularly to detect sandflies potentially infected with Leishmania spp.Key words: Leishmaniasis, Migonemyia migonei, Nyssomyia neivai.Nós objetivamos verificar a ocorrência de espécies de flebotomíneos em cinco municípios ao longo do rio do Peixe, no oeste de Santa Catarina, e verificar a presença de fêmeas naturalmente infectadas com Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle. Flebotomíneos foram coletados através de armadilha luminosa de Falcão e identificados no nível de espécie através de chaves dicotômicas. Um total de 149 espécimes de 10 espécies de flebotomíneos foi identificado, quatro dos quais de importância médica, pois já foram encontrados naturalmente infectados por Leishmania spp. Entretanto, usando a amplificação do kDNA de L. (L.) infantum através do ensaio de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex, nenhuma infecção natural foi observada nestes espécimes. A região não é endêmica para a leishmaniose e a baixa quantidade de espécimes coletados pode ter contribuído para os resultados negativos. No entanto, a presença simultânea de espécies de flebotomíneos relatados na literatura como naturalmente infectados por Leishmania spp. e um relato recente de cães naturalmente infectados com L. (L.) infantum demonstram a necessidade de expandir o monitoramento nesta região geográfica, particularmente para detectar flebotomíneos potencialmente infectados com Leishmania spp.Palavras-chave: Leishmaniose, Migonemyia migonei, Nyssomyia neivai

ANÁLISE DE MUTAÇÕES NO FRAGMENTO DO GENE QUE EXPRESSA A PROTEÍNA TRANSMEMBRANA DE CANAL DE SÓDIO (KDR) DE POPULAÇÕES DE Aedes SP. (DIPTERA: CULICIDAE) DA REGIÃO OESTE DO ESTADO DE SANTA CATARINA, BRASIL

Os mosquitos do gênero Aedes sp. tem grande importância epidemiológica no Brasil, em razão da capacidade de infecção viral a alguns mamíferos. Durante o repasto sanguíneo das fêmeas, podem ser transmitidos vírus causadores de doenças como a Dengue, Zika e Chikunguya. Dessa forma, o controle desses insetos está baseado na eliminação dos focos a partir da aplicação de inseticidas (piretroides e organofosforados). Contudo, os mosquitos podem desenvolver resistência aos inseticidas, em um fenômeno conhecido como “Knockdown resistance” (kdr), que consiste na resistência originada a partir de uma mudança no canal de sódio da membrana plasmática de suas células nervosas, impedindo a passagem do composto que afetaria o sistema nervoso dos mosquitos. Já foi reportado que uma mutação no códon 1016 desse gene acarreta a substituição de uma Valina (Val) por uma Isoleucina (Ile), ocasionando em uma população genótipos de resistência pelo efeito o efeito kdr. Para avaliar a existência de populações com esse genótipo resistente (Ile/Ile), foram avaliados mosquitos Aedes aegipty do Município de Chapecó, Oeste de Santa Catarina. As ovitrampas, cedidas pela DIVE/SC coletadas em 2014, foram utilizadas para a eclosão dos ovos em condições estabelecidas em laboratório e foram obtidos mosquitos na fase adulta. Foram utilizados 37 mosquitos machos e o DNA obtido por dois métodos: Chelex® (11 amostras) e Fenol-Clorofórimo (27). Em seguida, o DNA extraído foi utilizado para a genotipagem dos Val1016Ile  por meio de PCR. Considerou-se o alelo Val como selvagem dominante (A) e Ile como mutante recessivo (a). Os resultados foram calculados utilizando o princípio de Hardy-Weinberg. Observou-se uma melhor amplificação das bandas ao realizar extrações de DNA seguindo o protocolo Chelex®. A frequência alélica da população amostrada foi 0,4 para Val (A) e 0,6 para Ile (a). Também se observou que 43% da população de mosquitos proveniente de Chapecó apresentam o genótipo homozigoto recessivo Ile/Ile, que corresponde a indivíduos resistentes aos inseticidas, 19% de homozigotos dominantes (Val/Val) e 38% de heterozigotos Val/Ile, esses últimos determinando fenótipos susceptíveis aos inseticidas. Dessa forma, é possível indicar que as populações desses mosquitos existentes no Município estudado apresentam potencial para desenvolver resistência contra a ação dos inseticidas.Palavras-chave: Resistência. Valina. Inseticidas